來源頭條作者:合木千行技術(shù)團隊概述

基因測序可以分為“濕”實驗和“干”實驗兩個階段。其中“濕”實驗指的是將待測樣本利用實驗室方法進行核酸提取、文庫構(gòu)建（包括片段化、富集、擴增等一系列過程）到完成上機測序的實驗過程，而“干”實驗則是從得到下機數(shù)據(jù)開始，到完成生信分析和報告解讀的整個過程。可以認(rèn)為“濕“實驗是對樣本的處理，”干“實驗是對數(shù)據(jù)的處理。上機測序是介于“濕”和“干”實驗中間的重要環(huán)節(jié)，其中“機”指的是測序儀，它通過測序技術(shù)將熒光信號轉(zhuǎn)化成特定的ACGT四種堿基序列，完成從樣本中讀取遺傳信息的任務(wù)。自20世紀(jì)70年代以來，測序技術(shù)不斷發(fā)展升級，經(jīng)歷了多次技術(shù)革命，從第一代發(fā)展到了第三代測序技術(shù)，其通量和準(zhǔn)確性不斷提高，成本也在不斷降低。

生物信息分析是一個利用計算機科學(xué)和生物信息學(xué)工具、方法和技術(shù)，來對生命科學(xué)數(shù)據(jù)進行分析和研究的領(lǐng)域。廣義來講，根據(jù)其分析的側(cè)重和所處的階段可以被劃分為一級、二級、三級分析。其中，一級分析指的是將熒光信號轉(zhuǎn)化成堿基序列，完成堿基識別的過程；二級分析則是針對測序下機的堿基序列數(shù)據(jù)進行生物信息學(xué)計算的過程；最后，三級分析涉及到對二級生物信息分析的結(jié)果進行進一步解讀的過程。

一級分析

一級分析是利用測序技術(shù)將熒光信號轉(zhuǎn)換成四種堿基信號的過程，主要是basecall軟件通過堿基判讀技術(shù)和算法，從原始圖像中識別出堿基類型，將結(jié)果寫入cal文件，最終生成測序報告和FastQ數(shù)據(jù)。目前MPS技術(shù)的主流測序廠商illumina和MGI華大智造的測序系統(tǒng)，根據(jù)測序所使用的熒光種類數(shù)量的不同，可劃分為Four-Color、Two-Color和One-Color技術(shù)，三者的測序成本、準(zhǔn)確性和錯誤偏向都有其特點。以Two-Color為例，指用2種類型的熒光代表4種堿基，為了避免光譜crosstalk，選用的是紅、綠兩種熒光，不發(fā)光代表G堿基，紅光代表A堿基，綠光代表C堿基，同時發(fā)出紅綠光的代表T堿基。目前常見的basecall算法，利用對光學(xué)系統(tǒng)捕獲的光信號或直接從拍照的圖像出發(fā)，有利用先驗數(shù)值校正后基于半監(jiān)督的分類進行堿基判讀，也有基于機器學(xué)習(xí)方法進行堿基判讀等。

二級分析

什么是二級分析

生物信息學(xué)涉及領(lǐng)域廣泛、研究的側(cè)重點也不同，是一門交叉學(xué)科。通俗地講，生物信息分析指的是利用計算機對生物大數(shù)據(jù)進行操作，包括但不僅限于讀取、整理、分析和傳播等。所謂二級分析，是在一級分析下機數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，對數(shù)據(jù)進行更深入的處理，以獲得有意義的結(jié)果，包括進行序列質(zhì)量控制（去除低質(zhì)量序列和去除接頭序列等）、序列比對、基因表達分析和變異檢測等。二級分析的數(shù)據(jù)有三種常見類型：DNA數(shù)據(jù)、RNA數(shù)據(jù)和蛋白數(shù)據(jù)。

1、DNA數(shù)據(jù)

DNA數(shù)據(jù)的獲得一般是通過將DNA片段化后進行擴增測序得到，包括：全基因組測序（WGS）、全外顯子測序（WES）和靶向PCR擴增測序等。DNA分析通常關(guān)注motif、基因、點突變、InDel、拷貝數(shù)和結(jié)構(gòu)變異等。

2、RNA數(shù)據(jù)

RNA 數(shù)據(jù)的獲得需要先將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后再對cDNA進行擴增測序，測序內(nèi)容是RNA上的遺傳信息。依據(jù)不同的種類RNA、建庫方式等包括：小RNA測序（smallRNA）、轉(zhuǎn)錄組測序（mRNA）、長鏈非編碼RNA測序（lncRNA）、單細(xì)胞RNA測序（scRNA）等。RNA 分析通常關(guān)注基因表達、共表達、差異基因、互作方式、時序分析等。

3、蛋白數(shù)據(jù)

隨著質(zhì)譜技術(shù)的進步，對樣品中的多個蛋白質(zhì)進行高通量鑒定已經(jīng)成為可能。蛋白質(zhì)組學(xué)是一門研究蛋白質(zhì)組的學(xué)科，不僅涉及蛋白的定性和定量，還包括定位、修飾、相互作用、結(jié)構(gòu)、活性和功能分析。與基因組不同，蛋白質(zhì)組的組成會隨著時間和整個生物體的變化而不斷發(fā)生變化。

如何進行二級分析根據(jù)不同的分析目的，分析方法也不盡相同，需要具體情況具體分析。 以DNA數(shù)據(jù)進行WGS分析為例，主干分析流程包含數(shù)據(jù)質(zhì)控、比對、突變檢測(snp、InDel)、拷貝數(shù)變異、結(jié)構(gòu)變異等。而主干流程，每一步步驟用到的方法有許多選擇，如數(shù)據(jù)質(zhì)控依據(jù)測序數(shù)據(jù)來源特征、序列分布均勻性、插入片段長度分布、數(shù)據(jù)堿基分布特征、不同的堿基質(zhì)控方法等因素可選用不同的質(zhì)控軟件、程序?qū)Ρ冗M行。二級分析往往還需要整合、注釋公開的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫內(nèi)容，因此二級分析也需要熟悉使用各類常見數(shù)據(jù)庫。以下是一些常見的大名鼎鼎數(shù)據(jù)庫：

Refseq：NCBI Reference Sequence Database，意圖是為所有常見生物提供非冗余，人工選擇過的參考序列。

GenBank: Genetic sequence database from NCBI ，常用于下載參考基因序列或者上傳新測序的數(shù)據(jù)。GenBank上序列比較全面，與RefSeq 的主要區(qū)別在于RefSeq經(jīng)過了去冗余與檢驗，可信度比GenBank高。

UniProt: Protein sequence database，常用于獲取蛋白序列，蛋白質(zhì)組學(xué)分析需要用到。

GEO Database: Gene expression profiles from NCBI，含有已分析數(shù)據(jù)集的基因表達結(jié)果，常用于數(shù)據(jù)挖掘。隨著數(shù)據(jù)庫的流行，逐漸擴展業(yè)務(wù)到許多其它的高通量數(shù)據(jù)，比如：甲基化，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，基因組-蛋白交互作用等。

Expression Atlas: 提供了不同物種、不同生理條件的基因表達數(shù)據(jù)。

三級分析

什么是三級分析所謂的三級分析，通常也叫“遺傳分析”，是指結(jié)合患者臨床信息，對二級分析后的檢測結(jié)果進行臨床意義的解讀，并出具檢測報告。在臨床診療領(lǐng)域，目前應(yīng)用比較多的主要還是DNA數(shù)據(jù)，所以接下來我們重點介紹DNA數(shù)據(jù)結(jié)果的解讀分析。

如何進行三級分析1、數(shù)據(jù)篩選

經(jīng)過二級分析后，我們會得到樣本的變異檢測結(jié)果。以遺傳病領(lǐng)域目前比較流行的全外顯子組測序 (WES)為例，平均每個樣本會產(chǎn)生幾千甚至上萬個變異，這些變異首先需要按照一定的規(guī)則進行過濾篩選（比如去掉高人群頻率的變異；同義突變因為并不改變蛋白質(zhì)序列，普遍認(rèn)為不會產(chǎn)生突變效應(yīng)，一般也不予解讀），剩下的罕見變異再進行進一步的分析解讀。腫瘤精準(zhǔn)治療基因檢測項目的變異數(shù)量一般要少的多，但也需要進行過濾。

2、制定解讀規(guī)則

檢測結(jié)果經(jīng)過上述初步的篩選后，需要按照規(guī)則對剩下的變異進行詳細(xì)的解讀，雖然各家檢測機構(gòu)在解讀細(xì)則上會略有不同，但都需要遵循一些普遍的通用規(guī)則。針對遺傳病領(lǐng)域檢出的胚系突變，應(yīng)按照ACMG的胚系突變解讀流程進行注釋及解讀。基于當(dāng)前證據(jù)將胚系變異的致病性分為五個等級：致病、可能致病、意義不明確、可能良性和良性。針對腫瘤精準(zhǔn)治療領(lǐng)域常見的體細(xì)胞變異，目前比較受認(rèn)可的是2017年美國分子病理學(xué)協(xié)會（AMP）/美 國 臨 床 腫 瘤 學(xué) 會（ASCO）/美 國病 理 學(xué) 家 協(xié) 會（CAP）聯(lián)合制定的體細(xì)胞變異解讀指南，將體細(xì)胞變異分為Ⅰ類具有重要臨床意義的變異、Ⅱ類具有潛在臨床意義的變異、Ⅲ類臨床意義不明的變異和Ⅳ類無害或可能無害的變異。

3、結(jié)合解讀知識庫對結(jié)果進行臨床意義的解讀

人類大約有2萬多個基因，其中目前已知的跟遺傳病和腫瘤相關(guān)的基因就有數(shù)千種，這些基因分別是什么功能，與什么疾病相關(guān)。每一個基因的位點多則成千上萬個，變異可能發(fā)生在任何一個位點，某個位點發(fā)生變異后功能是受到激活還是抑制，與什么藥物相關(guān)，是導(dǎo)致敏感還是耐藥等等。上述這種臨床意義的解讀需要一個龐大的解讀知識庫的支持。臨床解讀知識庫的構(gòu)建需要整合當(dāng)前公共數(shù)據(jù)庫、指南共識及已發(fā)表文獻的海量信息。

4、解讀結(jié)果如何展示（報告模板）

變異結(jié)果有了，也知道它的臨床意義了，怎么展示給受檢者和醫(yī)生，需要一份對普通大眾閱讀友好的報告對結(jié)果進行展示，幫助受檢者簡單、快速的理解檢測結(jié)果。同時，也需要明確說明檢測范圍和以及檢測存在的局限性，并告知該檢測在臨床中發(fā)揮的角色（不可直接用于診療，而是輔助臨床醫(yī)生進行診療決策）。基于全面的解讀知識庫和嚴(yán)格的循證分級系統(tǒng)，遺傳分析人員對檢測出的變異進行篩選和評估，確定其可能的致病性和臨床意義，并據(jù)此出具通俗易懂的檢測報告。臨床醫(yī)生再結(jié)合受檢者的家庭史、臨床表現(xiàn)、生化指標(biāo)、影像學(xué)等綜合信息，進行最終的解讀和診療建議。

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